抗体和系列免疫检测技术全解析（三）：传统免疫检测技术

此前我们介绍了抗体基本知识和抗体免疫检测技术的原理（点击查看上一期），接下来我们将罗列比较通用的抗体免疫检测技术，介绍每种技术的实验原理、操作流程、注意事项，并进一步阐述这些技术在科研、临床诊断和生物医学研究中的重要应用，给大家进行一一的讲解。

内容概括如下：

3.1  酶联免疫吸附试验 (ELISA)：经典的抗体检测方法

3.2  Western Blot (WB)：检测蛋白质表达的“金标准”

3.3  免疫荧光 (IF)：活细胞内的动态抗体检测

3.4  流式细胞术 (Flow Cytometry, FACS)：高通量单细胞抗体检测技术

3.5  免疫沉淀和共免疫沉淀 (IP/Co-IP)：研究蛋白互作的利器

3.6  免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：组织切片中定位和定量特定蛋白质的技术

3.7  免疫检测技术常见问题汇总

 

3.1   酶联免疫吸附技术 (ELISA)：经典的抗体检测方法

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种应用于抗原和抗体检测的经典技术。

（1）ELISA实验原理

ELISA的核心是抗原或抗体在微孔板上的吸附和结合，通过加样、洗涤、抗体反应、酶标二抗的结合以及底物显色，最终通过分光光度计测量颜色变化来分析抗原或抗体的浓度。

图：间接法ELISA实验基本流程示例

（2）实验流程

一般情况下，ELISA的实验流程如下：

1. 样本加样：

• 在96孔板中添加抗原（或抗体），然后通过吸附作用使其固定在孔内。
• 根据实验的需要，选择合适的抗原/抗体浓度。

2. 孵育：

• 在37°C下孵育一定时间，促进抗原或抗体与孔内的其他组分反应。

3. 洗涤：

• 使用缓冲液清洗去除未结合的成分，以减少背景噪声。

4. 添加酶标记的二抗：

• 二抗与待测物（抗原或抗体）结合，标记的酶可以催化底物的反应，产生显色信号。

5. 显色反应：

• 加入底物，使其与酶发生反应，产生可见的颜色变化。
• 使用分光光度计测定吸光度。

6. 数据分析：

• 根据信号的强度与标准曲线对比，从而定量分析抗原或抗体浓度。

目前ELISA方法已衍生出直接法、间接法、夹心法、竞争法等多种方法。但每个方法都是基于抗原抗体相互结合的免疫原理，因此原理都大同小异。不同方法的差异性在于，通过引入二抗等因素放大信号可以增加检测的灵敏度或者通过多个抗体或者竞争可以减少假阳性。

 

3.2   Western Blot (WB)：检测蛋白质表达的“金标准”

Western Blot（WB）是一种用于蛋白质分子量分析和表达水平检测的技术。它能准确地确认目标蛋白的大小，并可以进一步分析其表达量。

（1）实验原理

Western Blot技术通过SDS-PAGE凝胶电泳将不同大小的蛋白质分离，然后将其转移到PVDF膜上，使用抗体识别目标蛋白，通过标记的二抗与酶的底物反应，最终获得蛋白质的表达信息。

图：Western Blot实验基本流程示例

（2）实验流程

1. 蛋白提取：

• 用RIPA裂解液，从细胞或组织中提取总蛋白。

2. SDS-PAGE凝胶电泳：

• 使用SDS-PAGE凝胶在电场存在情况下，根据蛋白分子量将不同蛋白进行进行分离。

3. 转膜：

• 通过电转移的方式将分离的蛋白质从PAGE凝胶转移到PVDF膜上，常用的转膜方法是湿转膜。

4. 封闭膜：

• 用5%奶粉或BSA封闭膜上的非特异性结合位点，避免抗体与膜的无关位点结合。

5. 一抗孵育：

• 加入针对目标蛋白的特异性一抗，孵育约1小时，确保抗体与目标蛋白结合。

6. 二抗孵育：

• 加入带有酶标的二抗，二抗与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。

7. 显色反应：

• 通过化学发光或底物显色反应，酶催化底物生成光信号，通过X光胶片或化学发光成像仪记录结果。

 

3.3   免疫荧光 (IF)：活细胞内的动态抗体检测

免疫荧光（IF）是一种能够在细胞和组织切片中实时检测抗体的技术。通过使用荧光标记抗体，可以观察细胞内部的抗原分布与定位。

（1）实验原理

免疫荧光技术利用荧光标记的抗体与目标抗原特异性结合，使用荧光显微镜观察信号。荧光标记的抗体能够在细胞内或组织切片中准确定位抗原。

图：免疫荧光实验流程图，展示从样本固定到荧光显微镜观察的步骤

（2）实验流程

1. 细胞准备：

• 对于单层生长细胞，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，用PBS洗两次。
• 对于悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤两次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

2. 固定：

• 根据需要选择适当的固定剂固定细胞。常用的固定剂有4%中性甲醛固定液（TBS缓冲液配制），固定15分钟后，用PBS洗涤3次，每次5分钟。

3. 通透：

• 使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。常用的通透剂有100%甲醇，处理5-15分钟。

4. 封闭：

• 使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30分钟。常用的封闭液有5%山羊血清。

5. 一抗结合：

• 室温孵育1小时或者4℃过夜。之后用PBST漂洗3次，每次冲洗5分钟。

6. 二抗结合：

• 间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1小时。之后用PBST漂洗3次，每次冲洗5分钟，再用蒸馏水漂洗一次。

7. 封片及检测：

• 滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

8. 复染核：

• 滴加DAPI避光孵育5分钟，对标本进行染核，生理盐水洗去多余的DAPI。

9. 荧光显微镜观察：

• 在荧光显微镜下观察并采集图像。

 

3.4   流式细胞术 (Flow Cytometry, FACS)：高通量单细胞抗体检测技术

流式细胞术是一种可以快速分析单个细胞表面或细胞内标志物的技术，能够同时检测多个参数，应用于免疫学、细胞生物学等领域。

（1）实验原理

流式细胞术利用荧光标记的抗体与细胞表面或细胞内的抗原结合，通过激光照射和荧光探测器获取细胞的多维数据。

图：直接法和间接法流式抗体结合原理

（2）实验流程

1. 细胞准备：

• 从组织或细胞培养中分离单个细胞。

2. 抗体染色：

• 使用荧光标记的抗体染色细胞，通过抗体与抗原的结合进行标记。

3. 流式检测：

• 将染色细胞通过流式细胞仪，通过激光进行多参数检测。

4. 数据分析：

• 将数据输入计算机，通过软件进行分析，生成细胞群体的表型图谱。

 

3.5   免疫沉淀和共免疫沉淀 (IP/Co-IP)：研究蛋白互作的利器

免疫沉淀技术通过利用抗体与目标蛋白结合，将其从复杂的生物样本中分离出来。共免疫沉淀则是在此基础上，利用目标蛋白与其他结合蛋白之间的相互作用，进一步捕获蛋白质复合物。这种技术常常用于探索蛋白质复合体的组成、研究细胞内信号传导路径，以及了解不同蛋白之间的相互作用。

实验流程

1. 样本制备：

• 提取细胞或组织中的总蛋白，通常使用裂解缓冲液（如RIPA缓冲液）来溶解细胞膜并释放细胞内容物。

2. 抗体结合：

• 将抗体加入样本中，抗体与目标蛋白结合。对于共免疫沉淀，除了目标蛋白的抗体，还可以加入针对可能与目标蛋白结合的其他蛋白的抗体。

3. 添加磁珠或Agarose珠：

• 抗体通常会与磁珠或琼脂糖珠结合，从而帮助沉淀抗原-抗体复合物。珠子经过孵育后，可以通过磁场或离心力将复合物沉淀出来。

4. 洗涤：

• 通过多次洗涤去除未结合的非特异性物质，确保最终沉淀中的蛋白质是与抗体特异性结合的目标蛋白。

5. 分析：

• 沉淀后的蛋白质可以通过Western Blot或质谱等技术进行进一步分析，以识别目标蛋白或探测其相互作用的蛋白。

 

3.6   免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：组织切片中定位和定量特定蛋白质的技术

免疫组化的原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合，通过将抗体与显色剂（如酶或荧光素）结合，来检测和定位组织切片中的特定蛋白质。这一技术允许研究人员在细胞或组织层面上观察和分析蛋白质的表达和分布。

实验流程

1. 组织切片制备：将组织样本固定、包埋、切片，制作成适合染色的组织切片。
2. 脱蜡和水化：将组织切片从石蜡中脱出，并逐步水化以便于抗体渗透。
3. 抗原修复：通过热处理或酶消化等方法暴露切片中的抗原决定簇。
4. 封闭：使用封闭液（如正常血清）封闭非特异性结合位点，减少背景噪音。
5. 一抗孵育：将特异性的一抗（针对目标蛋白的抗体）加入切片中，孵育使抗体与抗原结合。
6. 洗涤：用缓冲液洗涤切片，去除未结合的一抗。
7. 二抗孵育：加入与一抗相匹配的二抗，二抗上连接有显色剂。
8. 显色：使用底物溶液使显色剂催化反应，产生可见的颜色变化。
9. 复染：使用苏Mu精-伊红（H&E）等染料对细胞核进行染色，以便更好地观察细胞形态。
10. 脱水和封片：去除多余的水分，用封片剂覆盖切片，并用盖玻片封片。
11. 显微镜观察：使用显微镜观察切片，记录目标蛋白的表达和定位情况。

 

3.7   免疫检测技术常见问题汇总

在进行抗体免疫检测技术的实验时，常常会遇到一些挑战和问题。小编列举了常见的问题和解决方案，希望能为遇见问题的小伙伴提供帮助。

常见问题及解决方案

1. 背景信号过强：

• 原因：背景信号可能来源于非特异性结合、抗体浓度过高或封闭不完全。
• 解决方案：优化抗体的浓度、增加封闭步骤，并且使用不同的封闭液以减少背景信号。此外，确保样本中没有非特异性结合物质。

2. 低灵敏度：

• 原因：信号较弱通常由于抗体与目标蛋白结合的效率低、底物反应不充分或酶活性不高。
• 解决方案：使用更有效的酶标抗体，提高抗体浓度，或使用更敏感的底物反应。对于ELISA等技术，增加孵育时间和温度也有助于提高灵敏度。

3. 非特异性结合：

• 原因：抗体可能与其他非目标分子发生交叉反应，导致假阳性结果。
• 解决方案：使用高质量的抗体，并在优化的洗涤条件下进行实验。此外，可以通过选择更为专一的抗体进行实验。

4. 样本蛋白降解：

• 原因：蛋白质在提取和操作过程中可能会被降解，导致数据不准确。
• 解决方案：使用蛋白酶抑制剂、优化裂解条件、以及保持低温环境，尽量减少蛋白降解。

5. 荧光信号衰减（对于免疫荧光实验）：

• 原因：荧光标记的抗体可能因曝光过长而导致信号衰减。
• 解决方案：尽量减少样本暴露于光源的时间，使用抗光漂白剂来增加荧光信号的稳定性。

本次给大家介绍的免疫检测技术相对比较经典，随着科研的发展，越来越多的新兴免疫技术不断出现，以满足更多的客户需求。下个章节，我们将为大家介绍一些新的免疫检测技术。

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