QKine--用于人造肉与细胞农业的因子

用于生产优化牛和猪等特定物种的培养肉和脂肪生长因子

 

细胞农业有改变食品生产的潜力，并影响未来几代人的健康和福祉。通过培养动物细胞生产的培育肉类、鱼类、脂肪和乳制品，具有广阔的市场前景，但要将这些技术推向市场并实现成本平价，仍面临许多挑战。

 

 

用于培养这些细胞的细胞培养基是研发的一个重要领域。生物活性重组蛋白，尤其是生长因子和细胞因子，是大多数培育肉细胞培养基中的关键成分，除了某些鸡肉和鱼类培养基。生长因子蛋白具有高度活性，能够提供一组精心协调的生化信号，以控制细胞的生长和命运。

 

优化培育肉类和脂肪培养基的当务之急包括：

• 优化细胞培养基中的蛋白成分，以支持在生物反应器条件下有效集约的细胞扩增，并在必要时支持成熟过程

• 替代动物来源的成分，包括胎牛血清（FBS）

• 建立一个符合监管、操作、经济和科学要求的可信且稳固的供应链

 

一、物种特异性生长因子对于生产培育肉类是否必不可少？

许多人类生长因子也会激活动物细胞，尽管现有的数据有限，无法充分理解跨物种生物活性的相对效能和特异性。然而，近期强烈建议培育肉类公司使用相同物种的生长因子，或者至少使用非人类的生长因子。尽管据我们所知，目前尚无正式指导方针，但根据头部行业提交的反馈和美国食品药品监督管理局（FDA）的新口头建议，这似乎是明确的发展方向。

 

使用与物种匹配的生物活性蛋白无疑会使监管机构的审查更加顺利，有助于消费者的接受度，并可能提高能效，从而有助于降低培养基的成本。迫切需要适当控制的比较数据，以展示生长因子对动物细胞的相对效能。迄今为止，这主要由于商业试剂的缺乏、现有试剂的质量不稳定以及缺乏使用等同生化质量的重组蛋白和良好表征的细胞系进行的开放获取比较研究而成为一项挑战。

 

为应对该领域的科学和监管需求，我们正在开发和表征来自几个相关物种的相同生化质量的生长因子。与其他利益相关者合作，我们希望加速培养基的开发，并为猪和牛的诱导多能干细胞（iPSC）、胚胎干细胞（ESC）和间充质干细胞（MSC）培养生成开放获取的数据。

 

二、我们是否需要为牛和猪细胞培养基中的所有生长因子开发新的物种特异性形式？

对培育牛和猪细胞培养基的生长因子进行分析，以识别三种物种之间相同的蛋白质以及那些蛋白质序列不保守的生长因子，这些引发了对潜在物种特异性活性和监管需求的担忧。

 

该分析包括序列保守性（见Table 1）和功能域分析（数据未显示）。这些数据以及行业优先事项已被用于在Qkine优先开发与物种匹配的生长因子。以下生长因子被应用于培育肉类和脂肪的培养基配方中，并且在不同物种之间的保守性较差。

 

在此，我们重点关注FGF-2、TGFβ3和HGF：

• 成纤维细胞生长因子2（FGF-2），也称为碱性FGF，对于许多细胞系的增殖和维持干细胞的多能性至关重要。

• 转化生长因子β3（TGF-β3），用于间充质干细胞的维持和成肌细胞的分化。

• 表皮生长因子（EGF），常用于促进间充质、上皮和其他细胞类型的增殖和分化。

• 肝细胞生长因子（HGF），在牛成肌细胞的扩增和成熟中起重要作用。

• 血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB），是一种有效有丝分裂原，能促进细胞增殖和细胞质量的增加。

• 白血病抑制因子（LIF），用于维持或衍生某些类型的干细胞。

 

Table 1a: 在人类、牛和猪之间更为保守的生长因子

 

Table 1b: 在人类、牛和猪之间不保守的生长因子蛋白

 

三、物种特异性的FGF-2（bFGF）补充剂改善了猪诱导多能干细胞（iPSCs）的多能性维持，并揭示了两种长度的FGF-2在效力上的差异。

FGF-2通常用于调节多能干细胞（PSC）培养中的细胞增殖和分化。在ESCs和iPSCs的生长培养基中，FGF-2以短形式（145个氨基酸）或较长形式（154个氨基酸）的形式加入，后者包括核心结构区域和N-末端延伸。无论细胞来源物种如何，人类FGF-2通常用于动物干细胞的生长培养基中。或许不寻常的是，FGF-2的生物活性在物种间高度保守（数据未显示）。牛和猪FGF-2的氨基酸序列相同，与人类蛋白质相比，有两个氨基酸的差异。

 

猪诱导多能干细胞（piPSCs）能够自我更新并分化为脂肪和肌肉细胞。这些特性使它们成为培育肉类的理想候选细胞。开发出适用于猪iPSCs的理想生长培养基对于在长期细胞培养中维持多能性至关重要。猪iPSCs需要在其生长培养基中补充FGF-2以保持干细胞状态。

 

在这项研究中，我们观察到猪和人类的Qkine FGF-2变体都表现出有利于成功培养piPSCs的生物活性。使用人类或猪的FGF-2异构体培养piPSCs导致维持正常的菌落形态，如Figure 1所示。有趣的是，与在对照piPSC培养基中培养的相比，使用人类或猪的145aa FGF2变体补充培养导致piPSCs的生长速率增加。然而，当将标准维持培养基补充了人类或猪的154aa较长的FGF2异构体时，猪iPSCs的生长速率明显较慢。

 

尽管存在这些变化，每个使用Qkine FGF-2生长因子补充的piPSC培养中，多能性标记物OCT4和SOX2的表达保持稳定。值得注意的是，154aa的猪FGF2变体（Qk056）显示出更高的OCT4/SOX2比率，支持在piPSC培养基中利用猪特异性生长因子的潜在益处。请注意，对照piPSC培养基已经含有人类FGF-2，需要进一步的研究来充分阐明观察到的细胞增殖变化的机制。

Figure 1: 用不同形式的FGF-2培养的piPSCs。piPSCs在含有100ng/ml Qkine FGF-2的培养基中培养。A）亮场显微镜图像。B）生长曲线。C）多能性标记基因表达分析（OCT4/SOX2）。

 

piPSCs使用Geltrex包被的6孔板上的reLEsR进行团块传代。piPSCs在含有100ng/ml FGF-2（QK025、Qk027、Qk040和Qk056）的猪iPSC培养基中进行了至少5个传代的培养。在第5代，建立了每种生长因子培养的piPSCS的生长曲线。使用Accutase将piPSCs解离成单个细胞，并在Geltrex包被的24孔板上，每孔500μL含有1x revita细胞补充剂的培养基中，以10,000个细胞/孔的密度接种。在接下来的5天中，每天用含有每种FGF-2变体的500μL培养基培养细胞。连续5天进行三重细胞计数，并建立生长曲线。

 

在含有FGF-2的培养基中传代5次后，收获piPSCs并使用NEB Monarch Total RNA miniprep kit进行RNA提取。2μg的RNA转化为2μg CDNA，使用Applied Biosystems高容量cDNA逆转录试剂盒。将cDNA样品稀释至5ng/μl用于qPCR，每个96孔PCR板孔中使用10ng的cDNA。对猪GAPDH（内参）、猪OCT4（多能性）和猪SOX2（多能性）的引物从IDT订购。使用Quantstudio 1实时PCR系统进行qPCR。进行ΔΔCT分析以计算Qkine生长因子补充培养基与对照piPSC生长培养基中标记物OCT4/SOX2基因表达的相对倍增变化。

 

四、耐热的牛/猪FGF-2在培养中经过7天后仍保持生物活性，可以减少培养基更换的频率，并提高与工艺放大的兼容性。

FGF-2本身不稳定，容易发生蛋白水解降解和聚集。这种基本的生化不稳定性，造成其在培养基中的功能半衰期很短（<10小时），是需要频繁更换培养基并在干细胞增殖过程中改善均一性的重要因素。多能干细胞培养的质量对随后细胞分化和成熟过程中的细胞产量有重要影响。重组牛/猪FGF2-G3蛋白是FGF-2的一种耐热工程形式，支持开发优化的物种特异性无血清培养基。

 

使用人类热稳定的FGF2-G3改善iPSC培养计划的作用已经有充分的记录，而该蛋白在改善放大规模和在生物加工放大规模中对细胞质量产生均一性和可控性影响的效用正在细胞农业社区进行调查研究。然而，适用于制造放大规模的无标记牛/猪FGF2-G3的蛋白形式之前尚未可得。在本研究中，通过定量报告基因分析（Figure 2），显示了牛耐热型FGF-2的生物活性等效于野生型牛/猪FGF-2。

 

Figure 2: 野生型牛/猪FGF-2（黑色）和牛/猪FGF2-G3（绿色）具有等效的生物活性。Qk080牛/猪FGF2-G3（EC50 0.190 ng/ml）和Qk040野生型FGF-2（EC50 0.237 ng/ml）。

 

为了评估牛/猪FGF2-G3的功能半衰期的延长，蛋白在培养液中孵育48小时，以模拟细胞培养条件，然后进行生物活性分析。耐热的牛/猪FGF2-G3与野生型蛋白相比，在37°C条件下与培养液预孵育48小时后，保持完全的活性，而野生型蛋白则在培养中降解（Figure 3）。

 

我们的结果表明，FGF2-G3的功能半衰期从<10小时（野生型）增加到>48小时，与人类耐热FGF2-G3蛋白观察到的情况类似，这表明牛/猪FGF2-G3是培育肉类培养基优化的合适替代品。请注意，尽管像FGF2-G3这样的蛋白的工程形式为生物过程的优化和放大提供了独特的希望，但是使用工程蛋白可能会带来额外的监管障碍。然而，对细胞产量、培养计划和细胞培养的均一性的转变影响可能会促使与监管机构进行额外对话。

 

 

Figure 3: 比较Qk040野生型（WT）FGF-2在0小时（绿色）（EC50 0.237 ng/ml）和48小时（黑色）（EC50 1.75 ng/ml）的活性。

 

比较Qk080 FGF2-G3在0小时（绿色）（EC50 0.464 ng/ml）和48小时（黑色）（EC50 0.606 ng/ml）的活性。牛/猪FGF2-G3的活性是使用转染HEK293T细胞的血清反应元件荧光素酶报告基因分析测定的。细胞用FGF2-G3的系列稀释液处理3小时，进行了三次重复实验。WT FGF-2（Qk040）和FGF2-G3（Qk080）在条件培养基中稀释，并在37°C下孵育。样品在0小时和48小时时取样。FGF-2的活性使用Promega血清反应元件荧光素酶报告基因分析进行三次重复测定。结果归一化至0小时的最.大反应。

 

五、TGF-beta家族蛋白概述及物种特异性生长因子对猪iPSC培养的影响

TGF-beta超家族包括Activin A、TGF-β1-3、GDFs、GDNF和BMPs。这个蛋白家族在调控许多发育和生理过程中起着重要作用。Activin A和TGF-beta家族蛋白通常在牛和猪细胞培养中使用的培养基中是不可少的。

 

TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3是三个密切相关的TGF-β蛋白，它们在体内具有不同的生理作用、组织分布和发育表达模式。TGF-β1-3蛋白由不同的基因编码，它们在体内表达出独特的、有时是重叠的模式，并在细胞增殖、生长、分化和运动中发挥不同的功能。TGF-β蛋白是有效的信号分子，主要通过Smad 2/3介导的途径发挥作用，影响着细胞增殖、生长、分化和运动中。

 

TGF-β1在人类、猪和牛中更为保守，并且在许多商业ESC和iPSC培养基中使用，包括Essential 8和mTesR，这些培养基是培育肉类发展中使用的许多培养基的基础。相比之下，TGF-β3在物种间并不保守，但也用于无血清培养基中，包括B8和牛变种Beefy 9，以及许多间充质和成年动物来源的干细胞培养基。

 

值得注意的是，这个蛋白家族由于其结构复杂性而在制造过程中困难重重。蛋白的活性形式是二硫键连接的二聚体，蛋白的单聚体形式是无生物活性的。这个生长因子家族的需求很可能最终主导与生物活性重组蛋白培养基组分相关的商品成本，因为公司将扩大到>50升的规模，然后进入试验阶段。针对这一挑战，正在探索几种创新方法，包括基因方法来消除或减少对这些蛋白的需求；共培养和利用哺乳动物细胞在培养过程中分泌这些蛋白；以及开发优化的蛋白质和制造工艺，以解决供应链的能力和成本问题。

 

改善供应链，首先是开发可靠的物种特异性蛋白，并在这些数据基础上开发具有改进的制造产量或生物学特性的工程形式。在蛋白质制造过程中还存在创新的潜力，以将其特别定制为培育肉类产业的需求和规模。猪TGF-β3是使用无动物来源的微生物发酵工艺制造的。这种蛋白的生物活性与人类TGF-β3进行了直接比较（Figure 4、5），在人类细胞系上进行了定量荧光素酶报告基因分析，结果显示具有等效的生物活性。这是令人鼓舞的，并且表明可能存在将人类TGF-β3与猪蛋白进行同类替代的可能性。

 

 

Figure 4: 猪、牛和人类TGF-β3的多序列比对显示人类和猪TGF-β3之间的序列保守性约为98%，人类和牛TGF-β3之间的序列保守性约为99.%。

 

 

Figure 5：使用TGF-β3响应的萤火虫荧光素酶报告基因在HEK293T细胞中测定了人类和猪TGF-β3的活性。人类TGF-β3的EC50=39.53 pg/ml，猪TGF-β3的EC50=37.51 pg/ml。细胞用TGF-β3的系列稀释液处理6小时，进行了三次重复实验。测量萤火虫荧光素酶活性，并归一化至对照Renilla荧光素酶活性。

 

六、Qkine TGFβ1 维持猪iPSCs的多能性

使用来自龙生物技术公司（ Dragon Biotechnologies）的piPSC细胞系验证了Qkine人类/猪/牛TGFβ1和人类TGFβ3在培养中的有效性。当猪诱导多能干细胞（piPSCs）暴露于人类/牛/猪TGFβ1或人类TGFβ3时，表现出典型的菌落形态，并且与在标准条件下使用标准培养基培养的piPSCs相比，生长速度较大提高（Figure 6A-B）。在补充TGFβ1后，多能性标志物OCT4和SOX2的表达水平保持稳定，如Figure 6C所示。

 

 

Figure 6: 使用TGFβ1和TGFβ3培养的piPSCs。piPSCs在补充了2ng/ml Qkine TGFβ1或TGFβ3的培养基中培养。A）明场显微镜图像。B）生长曲线。C）多能性标志物（OCT4/SOX2）的基因表达分析。

 

然而，值得注意的是，引入人类TGFβ3会导致OCT4表达下降，这表明单独使用人类TGFβ3可能无法充分维持piPSCs的多能性，或者可能诱导其分化。人类和猪蛋白质的等效生物活性表明，在目前含有TGF-β3的人类培养基中，可以直接替换为猪TGF-β3，从而开发出物种匹配的培养基配方。需要进一步使用猪细胞系进行工作，以确定其在猪细胞培养中的相对效力，这将通过该生长因子的商业供应得到促进。

 

七、HGF 展现物种特异性活性，这表明使用人类 HGF 在牛细胞上的已发表数据可能需要重新评估。

HGF 是牛成肌细胞扩增和成熟培养基中的重要生长因子。此前，Qkine 开发了一种优化的无动物来源的天然序列活性人类 HGF 同功型 HGF NK1，因为所有现有的商业 HGF 蛋白都是使用动物或人类细胞蛋白表达系统生产的，限制了它们在转化研究中的应用。

 

为了扩展物种特异性 HGF 的可用性，Qkine 生产了牛和猪的 HGF NK1。使用报告基因测定法在人体细胞上比较了人类、牛和猪 HGF NK1 蛋白的活性。结果显示，牛 HGF NK1 和猪 HGF NK1 在人体细胞上的生物活性较低，这表明 HGF（NK1）在不同物种间存在活性差异。

 

 

Figure 7: 使用 Promega serum response element luciferase reporter assay (*) 在 HEK293T 细胞中测定人类和猪 HGF NK1 的活性。人类 HGF (NK1) 的 EC50 = 1.56 ng/ml；猪 HGF (NK1) 的 EC50 = 3.86 ng/ml；牛 HGF (NK1) 的 EC50 = 7.71 ng/ml。细胞被三次重复处理，并加入梯度稀释的 HGF NK1 处理3小时。测量萤火虫荧光素酶活性并标准化为对照 Renilla 荧光素酶活性。

 

来自人体细胞的生物活性测定数据显示 HGF NK1 表现出物种特异性差异。需要进一步使用牛和猪细胞进行实验，以确定其对培养肉工艺开发的影响。

 

培养肉、鱼、脂肪和乳制品是快速发展的领域，具有影响全球可持续发展的潜力。Qkine 致力于通过扩展商业上可用的物种特异性生长因子的范围，并支持开放合作、科学研究基础和可信的长期供应链，来支持细胞农业领域的发展。

 

Qkine，总部位于英国剑桥，是一家通过 ISO9001:2015 认证的公司。作为蛋白质创新的指引者，产品范围涵盖了多种应用领域，旨在提高您研究的可重复性。QKine积极支持并创新于新兴领域，如类器官和器官芯片、细胞农业、再生医学、合成水凝胶和生物打印等。

 

凭借强大的制造流程，QKine 生产高纯度、高品质、无动物成分的生长因子、细胞因子和其他复杂蛋白质， 可以通过提供批量预订、批量订单、定制装瓶和质量保证（QA ）来支持规模化和商业制造。

 

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