Small RNA—从功能研究到基因治疗

 

在过去的十年里，小RNAs（small RNA）已经成为基因表达和基因组功能的重要调节因子，几乎在生物学的各个方面都发挥着作用。许多小RNAs通过RNA干扰（RNAi）相关机制发挥作用，这些机制通过对RNA诱导沉默复合物（RISC）进行编程以识别和抑制目标。还有一类天然microRNAs（miRNAs），可在体内调节基因表达程序。miRNA功能的改变是导致人类疾病的一个重要因素，而对特定miRNA 的调控正成为一种新的治疗手段。小RNA的用途远不止如此，快来跟小编一起深入了解small RNA—从功能研究到基因治疗。

 

（1）小RNA起源

目前，我们对于通过RISC发挥作用的小RNAs的发生，认识比较全面。在动物中，这种小RNAs主要有三类：小干扰RNA（siRNAs）、PIWI相互作用RNA（piRNAs）和miRNAs。siRNAs是由RNAseⅢ家族酶dicer处理的双链前体衍生而来。在哺乳动物中，内源性siRNA在生殖细胞中较为丰富，但在无脊椎动物中则更为广泛。miRNA前体包含成熟miRNA序列的短发夹片段。这些前体通过两个双链RNA酶（dsRNA酶）Drosha和Dicer的串联作用进行处理。piRNAs主要在生殖细胞中表达，在生殖细胞中它们保护转座子的活性。它们的生物起源仍有待充分了解。

 

（2）小RNA发现

下一代测序技术使小RNAs的研究发生了革命性的改变。在将特定的连接子连接到小RNAs之后，可以生成cDNAs，这非常适合使用短读平台进行测序。这些方法扩大了被认为通过RISC起作用的小RNAs的种类，并使人们能够发现新的小RNAs。深度测序也被证明有助于检测特殊小RNA的表达；另一方面，如微阵列和定量pcr（qpcr），也提供了经济的替代方案，目前数据库已经在线提供已知的小RNA库。

 

（3）小RNA功能研究

了解小RNAs的功能通常从研究它们的表达模式开始。潜在靶点的识别依赖于小RNA和靶点必须具有一定的序列互补性的假设。计算算法根据miRNA-mRNA相互作用的假定特征及其结合位点的保守性预测miRNA靶点。此外，还发展了几种生物化学方法，如交联免疫沉淀法（CLIP）和串联亲和纯化miRNA靶基因mRNAs（Tap-Tar）。小RNAs的功能研究可以依赖于常规的遗传策略，如基因敲除。miRNA的过度表达和miRNA拮抗剂的使用也是常用的方法。拮抗剂是化学合成的miRNA互补寡核苷酸，其修饰的化学骨架可作为miRNA功能的反义抑制剂。模式生物，如秀丽隐杆线虫、果蝇和斑马鱼，也被证明是理解保守小RNAs功能的关键。

 

（4）小RNA工具类型

小rna通路的抑制潜能可以被重新定位到选定的细胞基因，使基因功能的研究成为可能。在哺乳动物中，有两种类型的RNAi triggers被广泛应用。通常在培养过程中，siRNAs被瞬时传递到细胞中，并进入RISC而无需进一步处理。shRNAs必须利用瞬时传递或基因组整合的载体进行表达，并且必须经过Drosha和Dicer或Dicer酶处理。siRNAs简单易用，但由于化学合成的triggers的持续性，它们只能暂时使目标沉默。shRNAs提供了更大的灵活性；整合的结构可以提供长久以由受调控的启动子表达，从而能够调节抑制水平并检查可逆效应。

 

（5）小RNA筛选工具

小RNA工具彻底改变了全基因组检测以寻找对特定表型有影响的蛋白质的能力。在哺乳动物全基因组和亚基因组中，合成siRNAs或shRNA表达载体的文库被广泛使用。此外，长dsRNAs文库已广泛应用于蠕虫和果蝇黑原细胞中，而且很容易获得表达dsRNA触发因子的转基因苍蝇的文库。

 

（6）体内研究策略

短发夹RNAs（shRNAs）是研究转基因动物基因功能的有力工具。通过移植shRNAs修饰的干细胞，可以培育出敲除目的基因的动物。这可以通过将优化的shRNAs整合到能够在大多数组织中表达的特定基因组位点来实现。这种策略为实现组织或细胞类型中任何基因的组织特异性或调节性抑制提供了可能。

 

（7）小RNAs靶向治疗

miRNAs自身或关键靶点结合位点的改变与人类疾病有关。这使得对特定miRNA的调控正成为一种新的治疗手段，目前已经开发了几种在体内释放拮抗剂的策略。这些方法已在包括啮齿动物和灵长类动物在内的临床前模型中得到验证，一些miRNA拮抗剂已进入人类临床试验

 

（8）小RNA基因治疗应用前景

利用小RNAs的单基因和全基因组方法在发现各种疾病的新治疗靶点方面都具有巨大的潜力。这些靶点中有些属于蛋白质类，这些蛋白质类可用于常规药物的发现。还有一部分被认为是“无成药性”的蛋白质类。在这些情况下，小RNAs本身提供了一种新的治疗方法，尽管将小RNA输送到体内的靶细胞具有挑战性，但许多研究小组已在寻求在特定疾病环境中表达shRNAs的基因治疗方法。

 

自 1995 年成立以来，Dharmacon 提供各种用于批量研究基因功能的工具，支持从全基因组范围到信号通路、基因家族方面研究基因与疾病、表型、分子机理对应的关系。

 

•  siRNA —— 在Targetplus siRNA 上获得双链修饰，提高了特异性和沉默效力。Accell siRNA 是一种可以在没有转染试剂的情况下传递给难以转染细胞的siRNA试剂。

•  shRNA —— microRNA适配的shRNA，用于组成型和诱导型RNAi，提供特异和有效的长期沉默。

•  microRNA —— 通过合理设计的合成和表达microRNA模拟物和发夹抑制剂上调或抑制内源性成熟microRNA功能。

 

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