肝脏负责代谢大多数药物，因此是受药物不良反应影响的主要组织之一。药物性肝损伤（DILI,drug induced liver injury）是几乎所有种类药物的潜在并发症。不幸的是，DILI在临床前药物开发过程中未被发现，或在临床首次被发现后暂停试验，等待进一步研究调查的情况并不罕见。在许多情况下，没有什么可担心的，因为通常停止用药会停止DILI反应。然而，有点令人不安的是，已知至少有750种FDA批准的药物具有一定程度的DILI风险[Thakkar et al., 2017]，而且太多潜在的新药由于过度的DILI风险而未获得批准。

为了降低药物的自然损耗率，需要在临床前研发管线中尽早确定潜在的人体DILI反应。这样可对有希望的药物的毒性问题通过“设计排除”。为了有效地降低这一过程的风险，需应对一些挑战，包括：

· 动物DILI研究及其与人类的有限相关性

· 动物模型曾错误地将有毒药物识别为安全药物，并将有用药物标记为有毒药物(Van Norman, 2019).

· 对于新的人类特异性药物形式，动物生理学不适用

· 需要改进标准体外试验模型的复杂性，使其以更准确地代表人体的方式表现和响应药物

· 历史上，使用传统方法筛选由预先存在的肝病或遗传易感性引起的特异性反应一直具有挑战性。

动物模型的不一致性，再加上2D肝脏培养的有限简单性，导致迫切需要更具预测性的临床前体外工具来研究DILI。最近的焦点集中在3D细胞培养平台上。这种方法产生了复杂和功能性的人体体外肝脏模型，有可能克服这些挑战，并在将药物从开发到上市时指导更明智的决策 [Weaver et al, 2020]。

 

一、体外DILI测试工作流程

每一种潜在药物在早期发现时都会经过一系列测试，从简单的高通量批量筛选细胞活力开始，这就提出了一个问题：该药物是否会杀死2D中生长的肝细胞？随着临床前阶段的发展，需要测试的药物和浓度要少得多，这种减少便于使用较低通量、更复杂的3D组织模型。通过采用这些方法，研究人员可以在进入临床之前更准确地预测体内DILI的风险。

肝脏是一个3D组织，因此，3D肝细胞模型，如细胞球体，与2D相比显示出更好的结果。在这里，细胞形成生理相关的细胞相互作用，最终产生更多类似体内的形态、代谢活性和延长培养的时间。就DILI的检测而言，2D批次筛选通常会检测到约三分之一对肝脏有不良影响的药物，然而，InSphero和阿斯利康之间的一项合作研究，使用3D原代人肝细胞和非实质细胞球体，通过鉴定出高达60%的DILI阳性化合物，改进了这一点(Procter et al., 2017)。但40%的药物仍未被检测到，因此，除了3D技术外，还有什么样的进步可以帮助识别所有具有DILI风险的药物？

虽然一些球体方法可产生肝细胞极化，但这些模型通常无法达到肝脏中的组织水平结构。此外，肝细胞具有异常的代谢能力，需要充足的氧气输送，这对球体培养物提出了挑战，因为球体培养物在营养扩散方面受到了众所周知的限制。在不重塑肝脏的高度有序组装的情况下，具有微妙或非常特殊作用的毒性药物可能会在不知情的情况下通过测试。与此同时，细胞培养模型之外的变量也会影响DILI。其他器官和组织可以调节肝细胞如何代谢药物。例如，肠道吸收药物的动力学可以影响肝脏中代谢物驱动的毒性。同样，疾病病理生理学（例如非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD））也可以改变肝脏对药物的反应，可能会加剧小剂量的损伤。能够将这些复合因素纳入临床前工具包将大大有助于确保只有肝损伤风险较低的药物进入临床试验。

二、通过“液流”获取更多相关信息

上述限制可以通过将灌注结合到3D培养中来解决。通过在连续灌注的3D支架上生长与生理学相关的原代肝细胞组合（包括那些具有基因变异的患者，这些变异会使患者患病），可以尽可能复制肝组织的微结构。随着流体持续循环以提供机械刺激、持续的氧输送和极化，这些微环境中的肝细胞可以维持高度功能化长达4周。

 

Fig 2: 肝脏芯片模型重建了肝脏微体系结构，并可以概括代谢性疾病（如NASH）的表型

 

除了扩展体外慢性给药研究的领域外，这些灌注器官芯片模型（OOC，Organ-On-Chip）通过将循环免疫细胞纳入系统，提供了更大的灵活性，以揭示免疫相关的毒性问题。还可能诱导常见的肝脏疾病模型（如NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎（NASH））以解密潜在的发病敏感性。

为了说明化合物毒性的多器官效应，液流使单个OOC能够连接在一起，形成多器官系统。这些系统可以模拟基本过程，如药物吸收和代谢，并能够理解器官之间的相互作用，如代谢物驱动的毒性、多器官毒性或炎症，这些在使用常规实验方法检测时可能不那么明显。虽然其通量可能较低，但OOC使研究人员能够超越简单地识别急性/慢性肝毒性的存在，或将体外结果转化为临床环境；它们使我们能够调查其中的原因。

三、使用多个实验终点回答更多问题

虽然在药物发现过程中，较简单的系统比以往任何时候都能成功地标记肝毒性信号的存在或不存在，但通过使用更复杂的灌注OOC系统来提供详细数据信息，这些系统得到了完美的补充。实现数据丰富性和高检测灵敏度需要一定量的体量。需要50万个由大量培养基（范围在1-2 mL之间）灌注的原代细胞产生足够的马力以复制第1和第2阶段代谢（特别重要，因为标准动物和体外模型被证明对DILI预测不佳的因素之一，是因为它们的非人代谢谱），并增加测定灵敏度，从而可以检测肝功能的复杂临床化学指标，例如ALT/AST。

但这是值得投资的，因为科学家现在可以利用更简单的2D或3D系统，甚至是使用“芯片”技术在微尺度上操作的灌注微生理系统（MPS，microphysiological system），在体外发现以前不可能的独特认知。纵向研究中随时间采集的样本提供了生物化学评估机会，随着时间的推移形成了一幅实验数据图谱。实验结束时回收的相对大量的组织可以在其他蛋白质组学或基因组学研究中进行分析，以查看基因的上调和下调，从而提供更完整的毒理学概况。

这种多重化的能力使研究人员能够超越简单地识别急性或慢性肝毒性的存在，或者将使用实验室培养的器官在体外获得的结果转化为临床环境，但它使我们能够研究原因背后的机制(Novac et al., 2021)。

四、了解原因有助于解决问题

了解任何特定毒性问题背后的机制是非常宝贵的。这些信息使团队有机会重新设计，有可能将项目从失败中拯救出来。通过机理指纹图谱或毒性曲线来指导重新设计，这一迭代过程大大提高了效率。

同样，生物学认知可以帮助研究人员确定哪些数据最相关。临床前动物试验中不时出现与人体试验或其他体内动物物种相矛盾的肝脏毒理学信号。在第一次人体内研究之前生成可比性的人体数据提供了一定的信心，以确保信号可能是受试动物物种的功能，而不是化合物本身引起的。这种认知可以防止项目不必要地终止。谁知道有多少潜在的重量级药物被阻止发挥其潜力？加州大学圣地亚哥分校（UCSD）以一个简短的客户网络研讨会强调了这一点。

五、获得超越小分子的毒理学见解

传统的毒理学工作往往侧重于小分子化合物，然而，新的人类特异性药物形式（如生物制剂、脂质纳米粒包裹的产品或基于寡核苷酸/RNA的治疗）已成为发现和开发的前沿。虽然这些新产品不太容易发生DILI，但仍有可能诱发肝损伤。Astellas Audentes的肌管性肌病基因治疗试验就是一个可怕的例子。虽然该疗法取得了令人鼓舞的结果，但4名肝衰竭患者的死亡无疑使其未来受到质疑。在这种情况下，OOC特别有利于测试安全性，因为它消除了导致动物模型不适用的遗传、代谢和/或免疫反应的障碍，同时也解决了体外平台缺乏生理液流和结构的问题。事实上，OOC对药物类型“不可知”，并确保组织相关部位的相关受体吸收相关分子。

Fig 3: 器官芯片模拟器官表型，使科学家能够重现与人体相关的药物剂量和相关毒性

六、方法范围

OOC提供了以前不可能的深刻毒理学认知。关于OOC有效性的既定共识，加上强烈的监管兴趣（keen regulatory interest）和减少动物使用的政治压力（political pressure to reduce animal usage ），正在推动对这一技术的采用。在药物发现过程中嵌入OOC技术，以尽早发现安全毒理学问题无疑将降低风险并提高效率。制药和生物技术公司正在追逐OOC技术；大型公司可能会发现，在内部建立实验流程是最佳途径，而对于小型或虚拟生物技术公司而言，专家的全方位实验服务可能提供更实用的方法。同样重要的是要注意，虽然不同的OOC系统在某些方面是相似的，但在其他方面却可能截然不同。因此，为项目选择正确的OOC系统是很重要的。如上所述，对于DILI研究而言，选择一种系统至关重要：

1）易于操作

2）产生大量用于取样的生物材料

3）结合生理相关液流系统

在CN Bio，我们提供一系列OOC选项，从内部采用设备自行研究（PhysioMimix OOC 系列微生理系统）到完整的药物代谢和安全性毒性测试服务（Drug Metabolism and Safety Toxicity Testing Service）。后一种选项有助于为希望外包的人更详细地确定药物诱导肝毒性的机制方面。我们的系统采用大多数细胞培养科学家所熟悉的开放式微孔板，能够产生大量样本（细胞数量和培养基），同时保持连续液流以产生生理相关结果。

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